Ako ste ikada provodili vrijeme analizirajući dijapozitive digitalne patologije ili uzorke za istraživanje slika, vjerojatno ste se zapitali kako skener dijapozitiva mikroskopa bilježi svaki detalj s takvom preciznošću – čak i kada dijapozitiv ima suptilne varijacije u visini ili sitne nedostatke koje bi odbacile fokus standardne kamere. Kao dobavljač digitalnih skenera za slajdove visokih performansi, stalno dobijam ovo pitanje, i to je jedan od najkritičnijih dijelova zašto naša oprema iz dana u dan daje pouzdane, dosljedne rezultate. Hajde da razjasnimo kako tačno funkcioniše mehanizam za fokusiranje, zašto je važan za različite slučajeve upotrebe i kako su naši skeneri konstruisani da budu izvrsni u ovoj oblasti.
Prvo, počnimo s osnovama: mikroskopska stakla nisu savršeno ravna. Standardna staklena pločica debljine je oko 1 mm, ali biološki uzorci (kao što su dijelovi tkiva, ćelijske kulture ili citološki preparati) su postavljeni na njega, a njihova visina može varirati od 10 do 50 mikrona - ponekad i više, ovisno o tome kako je uzorak pripremljen. Čak i manja prašina ili krhotine na toboganu dodaju male, neočekivane slojeve. Da bi skener snimio oštru sliku, njegov fokus se mora kontinuirano prilagođavati dok se kreće po slajdu, i to mora učiniti brže nego što ljudsko oko može treptati, zadržavajući tačnost unutar djelića mikrona. To nije mali podvig.
Većina skenera mikroskopskih dijapozitiva koristi jednu od dvije osnovne tehnologije fokusiranja: pasivni autofokus (AF) ili aktivni AF, a mnogi vrhunski modeli kombiniraju oboje kako bi dobili najbolje od oba svijeta. Počnimo s pasivnim AF-om, jer to je ono što smo ugradili u naše skenere svijetlog polja početnog nivoa kao što je Brightfield Slide Scanner EScan-1200. Pasivni AF ne emituje nikakav spoljni signal; umjesto toga, analizira svjetlost reflektovanu od slajda kako bi odredila gdje je najoštriji fokus. Softver sistema posmatra kontrast slike na malim prozorima dok skener pomera sočivo gore-dole. Kada je kontrast najveći, to je tačka oštrog fokusa. Za aplikacije sa svijetlim poljem, gdje su uzorci obojeni bojama koje stvaraju jasne razlike između svjetla i tame, ovo funkcionira jako dobro. Dovoljno je brz za skeniranje dijapozitiva sa svijetlim poljem pri uvećanju od 20x ili 40x, a smanjuje troškove za laboratorije kojima nije potrebna fluorescentna slika. Ali pasivni AF ima svoja ograničenja – ako slajd ima veoma ujednačenu oblast niskog kontrasta (kao što je ivica prozirnog stakla ili tanak, nezamrljani uzorak), softver ne može uočiti razlike u kontrastu i fokus bi mogao da se pomeri.
Tu dolazi aktivni AF, a ovo je tehnologija kojoj dajemo prioritet za istraživačke skenere, poput našeg istraživačkog fluorescentnog skenera slajdova. Aktivni AF koristi poseban senzor ili izvor svjetlosti da projektuje signal na klizač, a zatim mjeri kako se taj signal reflektuje nazad kako bi izračunao tačnu udaljenost od sočiva do uzorka. Dva najčešća tipa aktivnog AF-a koji se koriste u skenerima slajdova su laserska triangulacija i fokusiranje zasnovano na hromatskim aberacijama. Laserska triangulacija je jednostavnija: infracrveni laserski snop male snage je usmjeren na klizač, a senzor kamere otkriva gdje laserska tačka pada na tobogan. Ako je klizač preblizu ili predaleko, tačka se pomiče na senzoru, a skener prilagođava položaj sočiva kako bi se mjesto vratilo na idealnu tačku. Ovo radi čak i na uzorcima niskog kontrasta jer mjeri fizičku udaljenost, a ne kontrast svjetlosti. Fokusiranje hromatskih aberacija koristi izvor svetlosti koji se deli na različite talasne dužine boja; svaka talasna dužina se fokusira na nešto drugačiju udaljenost, tako da skener upoređuje kako se svaka boja odbija od slajda da bi izračunao fokus. Ovo je posebno korisno za fluorescentne slajdove, koji mogu imati čak niži kontrast od uzoraka svijetlog polja jer fluorofori emituju svjetlost, a ne reflektiraju je.
Mnogi naši skeneri, poput Digital Pathology Slide Scanner, koriste hibridni AF sistem koji kombinuje pasivni i aktivni AF kako bi eliminisao mrtve tačke. Evo kako to funkcionira: kada skener prvi put učita slajd, koristi aktivni AF za mapiranje cijelog profila visine slajda u prvih 10 sekundi. Ovo stvara "topografsku mapu" slajda, označavajući svaku neravninu, pad i varijaciju. Zatim, dok se skener kreće preko slajda snimajući slike, koristi pasivni AF za brzo podešavanje fokusa za svako pojedinačno vidno polje, koristeći prethodno učitanu mapu samo kada naiđe na područja u kojima bi pasivni AF imao problema. Ovaj hibridni pristup skraćuje vrijeme skeniranja, istovremeno osiguravajući da čak i lukavi uzorci, poput slajdova tkiva ugrađenih u parafin sa debelim, neravnim dijelovima, ostanu u fokusu na cijeloj slici.
Drugi ključni dio mehanizma za fokusiranje je piezo motor, koji zapravo pomiče sočivo ili pozornicu za podešavanje fokusa. Piezo motori se koriste umjesto standardnih koračnih motora jer su brži i precizniji: mogu podesiti poziciju u nanosekundama, s preciznošću do 10 nanometara – mnogo manje od najmanjeg detalja na uzorku tkiva. Za skeniranje sa velikim uvećanjem (poput 60x ili 100x, što je uobičajeno u istraživačkoj patologiji), o ovoj preciznosti se ne može pregovarati. Ako je fokus isključen čak za 0,5 mikrona, slika će biti mutna i propustit ćete male strukture poput jezgara ili proteinskih markera. Naš višekanalni fluorescentni skener koristi sistem piezo motora koji može napraviti preko 1000 podešavanja fokusa u sekundi, što znači da može skenirati 40x fluorescentni slajd u pola vremena skenera sa koračnim motorom, bez gubitka oštrine.
Čekaj, ali šta je sa slučajevima kada su uzorci debeli? Neki biološki uzorci, poput kliznih pločica organizama ili 3D ćelijskih kultura, debeli su desetine mikrona – tako da čak ni jedan sloj ne može obuhvatiti sve detalje. Tu dolazi funkcija Z-slaganja naših skenera, koja se direktno povezuje sa mehanizmom za fokusiranje. Umjesto fokusiranja jednom po vidnom polju, skener snima 3 do 5 slika u različitim fokusnim ravnima, a zatim ih spaja kako bi stvorio jednu sliku u fokusu koja uključuje svaki sloj uzorka. Za istraživačke aplikacije, ovo je neophodno za proučavanje 3D strukture tkiva ili ko-lokalizaciju više fluorescentnih markera. Naš digitalni patološki skener GScan-60 ima Z-stacking mod koji prilagođava fokus u koracima od 2 mikrona, tako da ne propustite nijedan detalj u debelim kliničkim uzorcima.
Iz prve ruke sam vidio kako loše fokusiranje može poremetiti istraživački ili dijagnostički rad laboratorije. Jedan moj kolega u maloj laboratoriji za patologiju jednom mi je rekao da koriste jeftiniji skener slajdova koji bi izgubio fokus na ivicama slajdova, prisiljavajući njihove patologe da ručno podese 20% slika. To je izgubilo sate vremena i dovelo do kašnjenja u dijagnozi pacijenata. Kada su prešli na naše skenere, hibridni AF sistem je smanjio ručna podešavanja na manje od 1%, a vreme skeniranja je smanjeno za 30%. To je prava vrednost dobro dizajniranog mehanizma fokusiranja—ne radi se samo o dobijanju jasne slike; radi se o uštedi vremena, smanjenju ljudske greške i omogućavanju preciznijih rezultata.
Postoji nekoliko uobičajenih mitova o fokusiranju slajd skenera koje također želim razjasniti. Neki ljudi misle da veće uvećanje znači da vam je potreban složeniji sistem fokusiranja, ali manje se radi o povećanju, a više o tipu uzorka. Na primjer, 40x dijapozitiv obojenog uzorka tkiva zahtijeva precizan fokus, ali 20x dijapozitiv ćelijskih kultura na ravnom staklenom predmetu može dobro funkcionirati s pasivnim AF. Drugi mitovi: da je aktivni AF uvijek sporiji od pasivnog AF. Sa modernim piezo motorima, aktivni AF je zapravo brži, jer ne mora skenirati više pozicija da bi pronašao najoštriji kontrast – on direktno izračunava udaljenost.
Drugi važan faktor u fokusiranju je kalibracija. Čak i najbolji mehanizam za fokusiranje neće raditi ako se ne kalibriše redovno. Naši skeneri dolaze s automatskim kalibracijskim rutinama koje se pokreću svaki put kada ubacite novu vrstu slajda, a mi pružamo vodiče korak po korak za ručnu kalibraciju ako je potrebno. Uz svaki skener uključujemo i probne slajdove kako bi laboratorije mogle provjeriti da li je fokus tačan. Za postavke istraživanja, gdje je dosljednost u eksperimentima ključna, ova kalibracija osigurava da su slike iz različitih skeniranja uporedive, čak i u razmaku od nekoliko mjeseci.
Sada, hajde da razgovaramo o tome kako konstruišemo naše mehanizme za fokusiranje da odgovaraju različitim potrebama kupaca. Istraživačkoj laboratoriji koja skenira fluorescentne slajdove potreban je sistem fokusiranja koji može podnijeti više fluorofora, koji mogu imati različite talasne dužine emisije. Naš fluorescentni skener slajdova za istraživanje je dizajniran sa senzorom koji uzima u obzir različite talasne dužine svetlosti, tako da fokus ostaje dosledan bilo da skenirate DAPI (plavi), FITC (zeleni) ili Texas Red (crveni) kanale. Za laboratorije za digitalnu patologiju, koje obrađuju stotine slajdova dnevno, brzina je kritična – naš hibridni AF sistem GScan-60 može skenirati cijeli slajd za manje od 5 minuta, a mehanizam fokusiranja ne postaje manje precizan tokom hiljada skeniranja jer koristimo izdržljive komponente industrijske klase.
Takođe su mi kupci postavljali pitanja o fokusiranju na vlažne slajdove, kao što su slajdovi sa živom slikom ćelija. Naši skeneri mogu podnijeti vlažne slajdove, ali preporučujemo korištenje aktivnog AF moda jer mokri uzorci mogu imati površinske refleksije koje zbunjuju pasivni AF. Aktivni AF baziran na laseru može prodrijeti u tanki sloj tekućine na stakalcu kako bi se fokusirao na sam uzorak, što je velika prednost za laboratorije koje rade time-lapse snimanje ćelijskih kultura.
Na kraju dana, mehanizam za fokusiranje je neopjevani heroj skenera mikroskopskih dijapozitiva. To je dio koji radi iza kulisa kako bi se zamućeno staklo pretvorilo u oštru, detaljnu digitalnu sliku koju istraživači mogu analizirati, patolozi mogu koristiti za postavljanje dijagnoze, a kliničari se mogu osloniti na planove liječenja. Bilo da vodite malu dijagnostičku laboratoriju, univerzitetsku istraživačku laboratoriju ili farmaceutsku kompaniju koja testira nove lijekove, pouzdan sistem fokusiranja nije luksuz – on je neophodan.
Ako ste na tržištu za mikroskopski skener dijapozitiva i želite saznati više o tome kako naša tehnologija fokusiranja može zadovoljiti vaše potrebe, naš tim je tu da vam pomogne. Od skenera sa svijetlim poljem za rutinsku dijagnostiku do istraživačkih fluorescentnih skenera za napredno snimanje, možemo vas provesti kroz funkcije koje su najvažnije za vaš rad. Bilo da ste zainteresirani za EScan-1200 za vašu patološku laboratoriju, GScan-60 za skeniranje velike propusnosti ili naše višekanalne fluorescentne skenere za vaše istraživanje, spremni smo da razgovaramo o tome kako naša oprema može pojednostaviti vaš radni tok i poboljšati vaše rezultate.
Reference
- Agrawal, M. i Gupta, R. (2021). Tehnologije autofokusa za digitalne skenere dijapozitiva patologije: komparativna analiza. Journal of Pathology Informatics, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Mehanizmi za fokusiranje visoke preciznosti za sisteme za snimanje cijelog dijapozitiva. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39(8), 2678-2687.
- Svjetska zdravstvena organizacija. (2019). Digitalna patologija za dijagnostičke i istraživačke aplikacije: tehničke specifikacije i najbolje prakse. WHO Press, Ženeva.
